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一株高效苯酚降解菌的筛选及降解性能考查
摘要：
从炼油厂废水排放口附近污染较为严重的土壤样本中驯化筛选、鉴定苯酚降解菌株，对该菌株在不同苯酚浓 度下进行降酚能力的考查。方法 采用以苯酚为唯一碳源、逐量分批的方法驯化、筛选苯酚降解菌株，利用形态学、生 理生化反应以及 16SrDNA 序列鉴定菌株。结果 筛选到一株苯酚降解菌株，鉴定为不动杆菌属，该菌株 48h 内对苯酚 （1 5g · L-1）的降解率为 82 86%。结论 经过驯化筛选和苯酚降解条件的优化，所得苯酚降解菌株具有良好的苯酚降 解能力。
关键词：
苯酚降解菌 驯化筛选 降解性能
姓名：
石瑞文 哈 妮 郭 楠 张晓琴 关海滨
作者单位：
（内蒙古医科大学 内蒙古·呼和浩特 010110）
栏目：
理论广角
页数：
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正文:工业化程度的提高使许多工厂大量排放含酚废水，水中 生物的生存和饮用水水源质量等都遭到极大的威胁。 生物法处理含酚废水具有能耗少、处理效率高、二次污染 少等优点。本研究旨在从酚类污染物排放企业所排出的污泥 以及被污染的土壤中筛选获得高效降酚菌群并分离出单一高 效降酚菌株，通过对获得的高效降酚菌株降酚能力的考查、培 养基的优化以及鉴定分类，为相关研究提供实验参考，为工业 化处理含酚废水提供理论依据。
 1 材料与方法
 1.1 培养基 （1）唯一碳源培养基：苯酚终浓度分别为0.1g·L-1至1.5g · L-1。（2）富集培养基：蛋白胨 10. 0g · L-1，牛肉浸膏 5. 0 g · L-1，NaCl 5. 0 g · L-1，pH7. 0。 （3）富集（分离）固体培养基：苯酚浓度若干、琼脂浓度为 15.0 g · L-1
 1.2 实验方法
 1.2.1 苯酚降解菌的分离与纯化 选取炼油厂废水排放口附近污染较为严重的土壤，溶于 无菌蒸馏水中，将其稀释液涂布于含有苯酚的分离固体培养 基梯度平板上。32℃培养 36 ～ 48h。选取生长在苯酚浓度较 高区域并且形态较好的细菌单菌落，于分离固体斜面培养基 上扩大培养。
 1.2.2 苯酚降解菌株的驯化、筛选 将 1.2.1 所得菌株接入含 0.1 g · L-1 苯酚的唯一碳源培 养基中，32 ℃，pH7.0，150 r/ min 振荡培养 24 h。重复上述培 养过程，直至苯酚浓度达到 1.5 g · L-1，选取单位时间内降酚 率较大的菌株。
1.2.3 苯酚降解菌生长量的测定及苯酚浓度的测定 以OD 600nm代表该菌体的生长状况，采用 4-氨基安替吡林 法测定苯酚浓度。 
1.2.4 苯酚降解率的计算 降解率(%) = (1－反应后苯酚浓度/苯酚起始浓度) × 100 % 
1.2.5 苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查 选取不同培养温度(T)、三角瓶装量(V)、摇床转速(v)等因 素对培养条件进行单一条件及正交优化。 
1.2.6 不同苯酚浓度下苯酚降解菌株的降酚能力考查 将处在对数生长期的菌液按 5%的接种量接入含苯酚浓 度分别为 0.3g · L-1、0.5g · L-1、1.0g · L-1、1.5g · L-1 的唯一 碳源培养基中，32℃，pH7.0，150r · min-1 培养，计算 48h 内苯 酚降解率。 
1.2.7 苯酚降解菌的鉴定 （1）传统方法鉴定。通过降酚菌株的个体和菌落特征、生 长状况、革兰氏染色以及生理生化反应初步鉴定该菌株。 （2）分子鉴定。设计细菌的 16SrDNA 序列通用引物，扩 增其 16SrDNA 序列，引物序列 F1：5′CCCAAGCTTG- GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′,F2: 5′CGGAATTCCG- TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，扩增条件 94℃、3min； （94℃、30sec；52℃、30sec；72℃、1 min）30 个循环；72℃、 5min；4℃保存，测序。 2 结果 2.1 苯酚降解菌株的分离筛选 经过分离筛选，共挑取 30 株耐酚菌株，选取其中降酚率 较高且遗传稳定的一株菌（HSG-18072313）作后续研究。 
2.2 苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查 菌株 HSG-18072313 最佳降解苯酚的培养温度(T)、三角 瓶装量 (V)、摇床转速 (v) 分别为：30℃、50ml/250ml、150r · min-1。
2.3 不同苯酚浓度下菌株 HSG-18072313 的降酚能力 48h 内对苯酚浓度为 0.3g · L-1、0.5g · L-1、1.0g · L-1、 1.5g · L-1 降解率分别为 93.28%、92.34%、89.56%、82.86%。 
2.4 菌株的鉴定 菌株 HSG-18072313 显微形态为杆状，菌落圆形，表面及 边缘光滑整齐，颜色为浅黄色，革兰氏染色呈阴性。 利用 blast 软件将菌株 HSG-18072313 的 16SrDNA 序列 与 Genebank 中已报道的 16SrDNA 序列进行同源性比较，结 果表明菌株 HSG-18072313 的 16SrDNA 序列与在 Genebank 登记的多株不动杆菌属的菌株具有高度的同源性（≥97%）。 结合显微和菌落鉴定结果、生理生化反应、分子鉴定，将 HSG-18072313 归属为不动杆菌属。 
（通讯作者：关海滨） 基金项目：内蒙古医科大学 2018 年度大学生创新创业 训练计划校级项目（2018101320041）；内蒙古医科大学2017年 度本科教学工程和教育教学改革项目（NYJXGG2017022）。 
作者简介：石瑞文（1981-），男，硕士研究生，讲师；通讯作 者：关海滨（1982-），男，硕士研究生，副教授，研究方向：生物技 术药物。
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